Clonage, production, purification et étude d’interaction fonctionnelle d’une GTPase humaine TC10 et de son effecteur, la protéine PAK.

1) Plasmide recombinantNous allons détailler la méthode de production des plasmides recombinants GST-TC10. La même méthode peut être utilisé pour fabriquer les plasmides MBP-PAK.Amorce On veut créer des amorces qui permettent d’amplifier spécifiquement TC10 tout en rajoutant les séquences reconnues par l’enzyme de restriction BamH1. Il faut penser à conserver le cadre de lecture de TC10.La banque de cDNA est composée de plusieurs cDNA double brins issue des ARNm d’une cellule humaine. L’annexe 1 du poly représente le cDNA qui contient la séquence de TC10. Seul un des deux brins est représenté, celui correspondant à la séquence d’ARNm.Il faut tout d’abord déterminer la partie codante de ce cDNA. Pour cela on à utilisé la carte des Cadres Ouvertes de Lecture (ORF). On estime que le plus grands cadre de lecture ouvert code pour la protéine. Elle est donc codée dans le 3ème cadre de lecture, entre les nucléotides 105 et 746. Puisque l’on travaille avec une protéine de fusion, on a préféré exclure le premier AUG afin de limiter les risques de démarrage de la traduction à cette endroit là (bien que le contexte ne soit sans doute pas favorable).Les amorces doivent être spécifiques, on a donc utilisé des amorces de 20 nucléotides ( (1/4)*10^20 = 10^-12chances de s’hybrider à un cDNA non désiré).L’élongation de la réplication s’effectue uniquement dans le sens 5’ -> 3’. On doit donc prendre une amorce en 5’ du gène et une en 3’. Comme on l'a exposé précédemment, nous avons retiré le premier ATG et nous avons ajouté les séquences reconnues par BamH1 aux extrémités 5' des amorces : Amorce 1 : 5' GGA TCC CCC GGA GCC GGC CGC AGC AGC 3'Amorce 2 : 3' TTG ACA ACA AAT TAA TGC ACT CCT AGG 5'. Afin de vérifier le bon fonctionnement de l'amplification par PCR de la région codante de TC10 (insert) et des extrémités BamH1, on analyse le produit de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. On utilise le marqueur afin d'identifier la taille des fragments obtenus par PCR et ainsi vérifier que celle ci a fonctionné.En effet, comme on peut le voir ci-dessus, au bout d'un certain nombre de cycles (18 cycles) on détecte des bandes entre 650 et 850 Kb ce qui correspond bien au fragment codant de TC10 lié aux sites BamH1 (651 paires de bases). Pour l'étape suivante de ligation on a utilisé un insert préparé au préalable. Pour la ligation on nous a fournit le vecteur linéarisé par BamH1 et l'insert clivé par la même enzyme de restriction pour créer des extrémités cohésives. L'utilisation de la T4 ADN ligase nous a permise d'insérer la séquence d'intérêt dans le plasmide A la fin, on obtient ainsi un plasmide recombinant, qui code pour la resistance à l'ampicilline (ce qui permettra la sélection des bactéries transformées) et un gène codant pour une protéine de fusion GST-TC10 sous le contrôle du promoteur de l'opéron lactose (facilement inductible). 2) TRANSFECTION ET CULTURES On va maintenant insérer le plasmide recombinant dans des bactéries E.coli pour exprimer les protéines. Plus précisément on a transfecté dans 4 tubes différents des E.coli avec le produit de ligation (L), le vecteur linéarisé avec la T4 ADN ligase (T1), un témoin négatif H2O (T2) et un témoin positif avec vecteur super-enroulé (T3). On les incube sur des boîtes de Pétri contenant de l'ampicilline toute la nuit. Si la ligation s'est correctement déroulée, on devrait observer des colonies sur les boîtes L et T3. Voici nos résultats :On constate un développement imprévu des colonies en T1. Normalement le vecteur linéarisé ne devrait pas doter les bactéries de la résistance à l'ampicilline, car il devrait être dégradé rapidement.On peut alors poser deux hypothèses :

• Le vecteur n'a jamais été linéarisé car l'enzyme de restriction était de mauvaise qualité
• Le vecteur s'est recircularisé grâce à la ligase. Ceci implique la présence des groupements phosphate en 5' des extrémités du vecteur, résultant d'une phosphatase inefficace.

Pour vérifier ces 2 hypothèses on peut imaginer une expérience similaire utilisant les mêmes conditions que T1 sans utiliser la ligase. Si les bactéries se developpent l'hypothèse 1 est verifiée ; sinon c'est l'hypothèse 2.Les bactéries recombinantes ainsi produites ont été utilisées pour effectuer 2 tests afin de vérifier la bonne insertion du gène d'intérêt dans le vecteur. Par contre pour les manipulations concernant la production des protéines on a utilisé des bactéries recombinantes fournies par l'enseignant. Cf * (schémas récapitulatif des manipulations). PCR SCREENAfin de vérifier la présence de la séquence dans le plasmide et son sens d'insertion, on effectue une PCR screen. Si l'insertion s'est correctement déroulée, elle entraînera la multiplication exponentielle de la partie insérée. Pour cela on va utiliser deux amorces : une complémentaire à l'extrémité 5' du TC10 (#1) ainsi qu'une nouvelle (#3), après la cassette.Si l'insertion n'a pas eu lieu dans le bon sens ou pas du tout, il n'y aura pas d'amplification. On a prélevé 4 colonies différentes à partir de la boîte L pour multiplier les chances de tomber sur un plasmide qui contient le gène inséré dans le bon sens. On fait ensuite migrer les produits de PCR ainsi qu'un marqueur sur gel d'agarose. On remarque ainsi que seules les bandes de petite taille (<100Kb : sans doute les amorces) sont observables : on peut donc conclure que l'insertion n'a pas fonctionné correctement.Remarque : on voit plusieurs bandes de faible intensité en L1. C'est du à une fuite du marqueur durant le pipetage. Malgré le fait que la PCR screen ait montré l'absence de la séquence TC10 dans le plasmide pGST, on a effectué le test Southern. On s'attend donc aussi à un résultat négatif.Grâce au kit d'extraction, on extrait les plasmides des colonies de bactéries recombinantes que l'on a crée à l'étape de transfection.On emploi la lyse alcaline et la chromatographie d'affinité (miniprep).On digère ensuite les plasmides par l'enzyme de restriction ApaI. Il existe un site ApaI (annexe 2 du poly) au début de la séquence de TC10 et un dans la cassette juste après l'endroit où s'insère TC10.

• Si l'insertion a eu lieu correctement, on doit avoir 2 fragments, un légèrement plus grand que TC10 et un représentant tout le reste du plasmide.
• Si l'insertion a eu lieu a l'envers, on aura un très grand fragment et un tout petit.
• S'il n'y a pas eu d'insertion, il n'y aura qu'un seul site ApaI et donc un seul fragment et une seule bande.

Après digestion, on fait migrer sur gel d'agarose et l'on observe une seule bande. La distance de migration de cette bande est approximativement de 3,75cm. En utilisant l'annexe en page 14 (distance de migration en fonction du log de la taille des fragments d'ADN linéaires), on peut déduire que le fragment mesure 3500 p.b. C'est approximativement la taille du plasmide : on peut alors supposer qu'il n'y a pas eu insertion (hypothèse 1). Remarque : une erreur de manipulation nous a forcé à redéposer le marqueur dans un autre puits.On transfère ensuite les bandes d'ADN sur une membrane de nylon par Southern blot. On va révéler la présence de TC10 grâce à une sonde spécifique que l'on à préparé spécifiquement. Pour la fabriquer, on s'est servit de l'ADN codant pour TC10 que l'on a répliquer avec des nucléotides portant un antigène, le DIG qui sera reconnu par un anticorps qui réagit avec son substrat pour donner une coloration. On pourra ainsi mettre en évidence la présence de TC10 dans le plasmide. Pourtant cette manipulation semblerait inutile dans un laboratoire : nous avons déjà prouvé l'absence de TC10. Justement, aucune coloration n'est visible sur la membrane, ce qui confirme l'hypothèse d'absence de TC10. Les tests précédents ayant été négatifs, on a utilisé des bactéries recombinées préparées à l'avance par l'enseignant (une souche GST-TC10 et une souche MBP-PAK). On a testé leur production de protéines recombinantes. Pour cela on les a cultivées en milieu liquide toujours en présence d'ampicilline (pour assurer la conservation du plasmide). Toutefois on n’a pas attendu que les bactéries soient rentrées dans la phase exponentielle de leur croissance (lors du maximum de l'activité de la synthèse protéique) soit une DO600 comprise entre 0,6 et 0,8. On a du s'arrêter lorsque les DO respectives des bactéries transformées par GST-TC10 et MBP-PAK étaient 0,228 et 0,281.Par conséquent, la concentration en protéines risque d'être plus faible que désirée.Sachant que les gènes GST-TC10 et MBP-PAK sont tous les deux sous le contrôle du promoteur de l’opéron lactose, ils ne sont pas exprimés tant que l'activation n'est pas induite (lactose/IPTG)A l'instant t0, on prélève un aliquote du mélange bactérien à partir duquel on purifie les protéines. Le promoteur n'a donc pas été activé et on obtient 2 tubes témoin négatif (T0, P0).On induit ensuite l’expression de protéines recombinantes grâce à de l’IPTG qui est un analogue du lactose non métabolisable et qui va activer le Promoteur lac.Après un temps d’incubation de 3h on prélève un aliquote du mélange bactérien à partir duquel on purifie les protéines (T3, P3).

• T0 : protéines des bactéries transformées par pGST-TC10 avant l’induction par IPTG
• T3 : protéines des bactéries transformées par pGST-TC10 3h après l’induction par IPTG
• P0 : protéines des bactéries transformées par pMBP-PAK avant l’induction par IPTG
• P3 : protéines des bactéries transformées par pMBP-PAK 3h après l’induction par IPTG

On va analyser les protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE-SDS), le SDS dénaturant les protéines ce qui permet de les séparer uniquement en fonction de leur taille. Remarque : le marqueur a mal migré a cause d'une bulle présente dans le puits. On observe ainsi une bande dans T3 qui n’est présente dans T0 : on peut supposer qu’il s’agit de GST-TC10. De même, dans P3, on observe une bande supplémentaire par rapport à P0 qui pourrait représenter MBP-PAK. On peut donc constater la bonne transformation des bactéries fournis par l'enseignant. On va maintenant tester l’interaction TC10-PAK en utilisant un support de chromatographie d’affinité.Pour cela il faut extraire les protéines produites par les deux souches de bactéries et les purifier séparément.Pour MBP-PAK on utilise des billes d'agarose greffées avec un ligand de MBP : l'amylose.Pour GST-TC10 ce sont des billes aimantées portant du glutathion à leur surface (substrat du GST). Partant de l'hypothèse que TC10 appartient à la famille des Rho GTPases, elle devrait s'activer en se liant avec le GTP. Et par la suite, cette forme active devrait s'associer à PAK. Dans le cas inverse,c'est à dire sous forme inactive (liée avec le GDP), TC10 ne doit pas s'associer à PAK.Ainsi, on sépare la suspension de billes GST-TC10 en deux parties: une que l'on charge par la suite avec du GDP (Tube D = Bille-Glutathion:GST-TC10:GDP) Et l'autre que l'on charge avec du GTP (Tube T = Bille-Glutathion:GST-TC10:GTP) Le MBP-PAK est lié à des billes d'agarose. On l'élue afin de le rajouter à chaque tube (T et D). A ce moment on prélève 2 aliquotes qui serviront comme témoin positif (vérifier la présence de MBP-PAK) pour le western blot qui va suivre :

• tube TT = Bille-Glutathion:GST-TC10:GTP + MBP-PAK
• tube DT = Bille-Glutathion:GST-TC10:GDP + MBP-PAK

On incube par la suite les tubes qui contiennent le reste du mélange protéique (nommés respectivement DL et TL) afin que la liaison entre TC10:GTP et MBP-PAK puisse avoir lieu. Grâce aux étapes de lavage on élimine les protéines n'ayant pas été liés aux complexe des billes. Si l'expérience a fonctionné correctement, dans le tube TL on doit retrouver le MBP-PAK associé au GST-TC10:GTP, alors que dans le DL le MBP-PAK non (il sera éliminé par le lavage).On a fait migrer les 4 tubes (TT, TL ,DT et DL) sur un gel de polyacrylamide. On a obtenu des bandes de faible intensité. Pour révéler la présence de MBP-PAK on a transféré le gel sur une membrane et on a détecté sa présence grâce aux anticorps anti-MBP. On obtient les bandes suivantes. Comme on a pu le constater, MBP-PAK est présent dans les tubes TT et DT (témoins positif sans lavage) et dans TL. Ce dernier a subit plusieurs lavages ce qui prouve que MBP-PAK était lié à GST-TC10. MBP-PAK est absent de DL. Il a donc été éliminé pendant les lavages. L'association avec le GTP est donc indispensable pour la liaison TC10-PAK. On veut maintenant tester l'association des protéines in vivo. Pour cela on crée quatre souches de levure modifiées qui expriment 2 plasmides différents dans chaque levure :

• Un possède la capacité de synthétiser le Tryptophane et contient le gène TC10 (sauvage ou muté) couplé à une séquence codant pour un domaine liant l'ADN d'un facteur de transcription : c'est le plasmide pLEX A.
• L'autre plasmide, pADGAL, possède la capacité de synthétiser la leucine et le gène PAK lié à une partie de protéine qui est un domaine d'activation de la transcription appartenant au même facteur que le domaine liant l'ADN présent dans pLEX A.

Grâce à la capacité de synthétiser Trp et Leu des 2 plasmides, en utilisant un milieu sélectif DO-Trp-Leu, seules les levures ayant incorporer les 2 plasmides se développeront. Remarque : On observe la contamination des boîtes de culture par des champignons. Il y a donc eu une erreur de manipulation dans le champ stérile (le bec s'est éteint). On a dénombré les colonies qui se sont développées:

• TC10+-PAK+ 12 colonies
• TC10+-PAK- 0 colonies
• TC10--PAK+ 42 colonies
• TC10--PAK- 77 colonies

Remarque : Pour l'utilisation de TC10+-PAK- , nous avons donc du utilisé les colonies d'un autre groupe. On a ensuite prélevé 2 colonies de chaque type de levure que l'on a mis en culture sur boîte de Pétri en milieu sélectif. Après développement des levures, on a coulé un gel d'agar mou/X-gal sur nos colonies : on observe une coloration bleu autour des colonies TC10+-PAK+. Cette coloration bleu est spécifique de la dégradation du galactose par la β-galactosidase : on a eu activation du gène rapporteur. On sait que l'opérateur de ce gène nécessite pour être activé d'être reconnu par le facteur cité précédemment comportant les 2 domaines protéiques (celui se liant à l'ADN et celui qui reconnaît et transactive l'ARN-polymérase). Or dans l'expérience, ces 2 domaines sont séparés. Étant donné que seulement les levures TC10+-PAK+ dégradent le galactose, on peut donc dire que TC10 se lie à PAK dans la cellule. Vu que dans les autres levures TC10 et/ou PAK est muté, la liaison ne peut avoir lieu et l'opérateur n'est donc pas activé c'est la raison pour laquelle le galactose n'est pas dégradé. Ce sont des témoins négatifs. les deux techniques utilisées conduisent au même résultat : l'interaction TC10-PAK est bien réelle et obéit à la règle de la famille des petites GTPases puisque le GTP est nécessaire à leur liaison. L'utilisation de E. coli et de la levure en parallèle permet de démontrer que l'interaction TC10-PAK à lieu in vitro comme in vivo.